Фенотипирование альфа-1-антитрипсина с помощью изоэлектрофокусирования PIM, PiZ, PiS и другие аллельные формы (эмфизема, ХОБЛ)

α1-антитрипсин, фенотипирование.

α1-Antitrypsin Phenotyping, Alpha-1-Antitrypsin Phenotype, A1A Phenotyping, AAT Phenotyping, PiTyping.

Изоэлектрофокусирование (IEF).

Венозную кровь.

1. Не курить в течение 30 минут до исследования.

Альфа-1-антитрипсин - это белок, который синтезируется в печени и обладает способностью угнетать активность некоторых протеаз - ферментов, разрушающих белковые структуры. Молекула α1-антитрипсина состоит из 418 аминокислот, порядок которых закодирован в гене Pi, расположенном на 14-й хромосоме. Человек получает от каждого из родителей по одному варианту (аллелю) гена Pi, причем оба аллеля доминантны - это значит, что постройка молекул α1-антитрипсина происходит с каждого из них.

Ген Pi обладает выраженным полиморфизмом - к настоящему времени известно более 100 его вариаций, в каждой из которых есть единичные изменения закодированной последовательности аминокислот в молекуле α1-антитрипсина. В некоторых случаях это не приводит к функционально значимым изменениям белка - такие аллели называются нормальными. Однако около 30 вариантов гена Pi приводят к постройке функционально неполноценных молекул α1-антитрипсина и снижению его концентрации в крови.

Специфической мишенью действия α1-антитрипсина является нейтрофильная эластаза. Этот фермент, содержащийся в некоторых лейкоцитах, способен разрушать различные белки, в том числе коллаген и эластин, которые являются основными компонентами внеклеточного вещества и способствуют поддержанию структуры органов и тканей, выполняя роль своеобразного каркаса. Чужеродные компоненты - микроорганизмы, частицы пыли и дыма, попадающие в легкие вместе с вдыхаемым воздухом, вызывают неспецифическую защитную реакцию находящихся там нейтрофильных лейкоцитов, сопровождающуюся выбросом протеолитических ферментов, в том числе нейтрофильной эластазы. В норме продолжительность действия протеолитических ферментов короткая благодаря их быстрой инактивации α1-антитрипсином. Однако при недостаточности α1-антитрипсина отсутствует контроль за активностью протеолитических ферментов в легочной ткани, вследствие чего компоненты эластического каркаса легких подвергаются медленному разрушению, что приводит к формированию обструктивных заболеваний и эмфиземы.

Выявление продуктов мутированного гена Pi в сыворотке крови называется фенотипированием и позволяет обнаружить мутацию в гене α1-антитрипсина. Золотым стандартом диагностики недостаточности α1-антитрипсина является метод изоэлектрического фокусирования. Он основан на том, что вследствие даже единичных изменений в аминокислотной последовательности молекулы α1-антитрипсина изменяют свои электрические свойства и при электрофорезе в геле двигаются с неодинаковой скоростью, останавливаются и накапливаются в разных местах. Различия в электрофоретической подвижности продуктов аллелей гена Pi легли в основу их обозначения: быстро мигрирующие от отрицательного электрода к положительному варианты α1-антитрипсина обозначаются начальными буквами латинского алфавита, медленные - конечными.

Так, нормальный аллель продвигается к середине геля и попадает в М-область - соответственно, нормальным фенотипом является PiMM (две буквы М означают, что нормальный белок кодируется каждым из двух генов Pi). Наиболее частый аллель, приводящий к дефициту α1-антитрипсина, двигается медленно и остается расположенным близко к отрицательному электроду - в Z-области, соответственно, обозначается PiZ. Другим часто встречающимся дефицитным аллелем является РiS. Аллели S и Z производят ненормальный белок, основная часть которого так и остается в клетках печени, разрушается там и не попадает в кровяное русло. С этим также связано то, что в некоторых случаях генетический дефицит α1-антитрипсина проявляется поражением печени с исходом в цирроз. При наличии патологического аллеля он может быть представлен только на одном гене - тогда в обозначении фенотипа останется одна буква М, обозначающая нормальный аллель, а вторая будет обозначать патологический, например PiMZ. Такая комбинация называется гетерозигота. Сочетание двух одинаковых аллелей гена Pi называется гомозиготой.

• Для выявления наследственной недостаточности α1-антитрипсина, которая ассоциирована, в том числе, с заболеваниями дыхательной системы, такими как эмфизема и хроническая обструктивная болезнь легких.

Исследованию фенотипа α1-антитрипсина подлежат следующие пациенты:

• люди, у которых выявлена сниженная концентрация α1-антитрипсина в крови;
• кровные родственники лиц с доказанной недостаточностью α1-антитрипсина;
• один из супругов, если у другого имеется 1 или 2 аллеля Z - в рамках обследования при планировании беременности.

Результат исследования представляет собой описание выявленного фенотипа α1-антитрипсина, а также может содержать сведения о клиническом значении обнаруженного сочетания аллелей в развитии патологии легких.

Наиболее часто встречающиеся варианты фенотипа α1-антитрипсина:

• PiMM - нормальный фенотип, встречается у 86,5% людей.
• PiZZ - гомозиготный вариант дефицитного аллеля, с ним ассоциированы тяжелые клинические проявления недостаточности α1-антитрипсина не только со стороны легких, но и со стороны печени ввиду накопления патологического белка в гепатоцитах. Является показанием к назначению заместительной терапии препаратами α1-антитрипсина. Частота в популяции 0,05%.
• PiMZ - гетерозигота, с одним нормальным аллелем и одним дефицитным. У лиц с таким фенотипом отмечается предрасположенность к заболеваниям легких и печени, которая значительно усугубляется курением, а также при регулярных контактах с дымом и пылью, например при использовании печного отопления или профессиональной деятельности в условиях повышенной задымленности. Частота в популяции - около 3,9%.
• PiMS - гетерозиготы с таким фенотипом обычно производят достаточно α1-антитрипсина (около 80% от нормы) для защиты легких. Распространенность фенотипа в популяции 8%.
• PiSZ - гетерозигота с дефицитными аллелями, как и в случае с MZ, имеется высокий риск развития легочной патологии, особенно при курении или регулярных контактах с дымом и пылью (печное отопление, работа в условиях повышенной задымленности). Частота в популяции 0,3%.
• PiSS - гомозигота по дефицитному аллелю S, однако, несмотря на это, в организме при таком фенотипе производится достаточно α1-антитрипсина для предотвращения заболеваний легких. Процент активности α1-антитрипсина - около 60% от нормы.

• Современные стандарты лечения α1-антитрипсиновой недостаточности предполагают в некоторых случаях применение препаратов α1-антитрипсина, полученных из донорской крови. Не рекомендуется проводить исследование во время заместительной терапии, так как при этом выявится 2 фенотипа: пациента и донорского белка.

Существует также аллель Null, который обозначает выключенный ген - с него не происходит построения молекул α1-антитрипсина. Однако так как изоэлектрическое фокусирование выявляет только продукты работы генов, в случае сочетания аллеля Null с другим аллелем будет обнаружен только продукт второго и результат исследования будет выглядеть как гомозиготный фенотип. В случаях сочетания Null с нормальным аллелем М или с аллелем S, который не приводит к выраженному дефициту α1-антитрипсина, результаты фенотипирования не будут коррелировать с пониженным сывороточным уровнем α1-антитрипсина. В таких случаях необходимо генетическое исследование.

• Альфа-1-антитрипсин
• Генотипирование (секвенирование) гена α1-антитрипсина

Пульмонолог, гастроэнтеролог, терапевт, неонатолог, ревматолог.

1. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 23e by Richard A. McPherson MD MSc (Author), Matthew R. Pincus MD PhD (Author). St. Louis, Missouri : Elsevier, 2016. Pages 259-260.
2. A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, 9th Edition, by Frances Fischbach, Marshall B. Dunning III. Wolters Kluwer Health, 2015. Pages 426-427.
3. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. - T. I / Под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. С. 215-216.
4. Пульмонология: национальное руководство / Под ред. А. Г. Чучалина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. С. 363-366.
5. Первичная эмфизема легких у молодого мужчины, обусловленная гомозиготным дефицитом α1-антитрипсина (генотип ZZ): перспективы организации помощи больным. Т. Е. Гембицкая, А. Г. Черменский, М. М. Илькович, С. Цампруби. Пульмонология, №6, 2014. С. 115- 120.