Полное секвенирование экзома

Секвенирование нового поколения (NGS).

Венозную кровь.

Экзом - это часть генома, отвечающая за синтез белка в организме. Экзом человека соответствует примерно 1 % всего генома, или 30 миллионам пар нуклеотидов. Мутации в экзоме составляют до 85 % от всех мутаций, связанных с болезнями. В большинстве клинических случаев достаточно данных, полученных в результате прочтения экзома. Поэтому исследование экзома является эффективным и важным инструментом генетического обследования, а также заменяет дорогостоящие анализы отдельных генов и полного генома.

Геном человека состоит более чем из трех миллиардов нуклеотидов. Экзом составляет около 1-2 % генома человека, но около 85 % всех вызывающих наследственные заболевания генетических вариантов находятся именно в кодирующих областях. При секвенировании генома, экзома или панели генов можно получить информацию об изменениях ДНК - генетических вариантах. Способность метода выявить вызывающий заболевание вариант зависит от типа изменения ДНК и от того, в каком участке ДНК он находится. Генетические варианты могут быть известными (описанными в литературе или специализированных базах данных) или неизвестными (не описанными ранее). Определение клинического значения прежде не описанных в литературе вариантов может быть затруднительным или неточным/недостоверным.

Секвенирование заключается в определении последовательности ДНК, выделенной из исследуемого биоматериала. Генетический вариант - это изменение нуклеотидной последовательности ДНК обследуемого относительно усредненного унифицированного (референсного) генома человека.

Полноэкзомное секвенирование - это секвенирование всех белоккодирующих генов человека (приблизительно 20 000), а секвенирование экзома с клинической целью - это секвенирование порядка 5000 генов, про которые на настоящий момент известна ассоциация с генетическими болезнями или признаками. Экзом составляет всего ~ 1 % от полного генома человека, но приблизительно 85 % всех болезнетворных вариантов находятся именно в белоккодирующих областях. С помощью технологии секвенирования экзома можно определить последовательность 90-95 % целевых участков человека, и некоторые участки поддаются секвенированию с помощью этой методики несколько хуже. Способность метода выявить болезнетворный вариант зависит от того, в каком участке он находится.

Метод предназначен для поиска однонуклеотидных замен в кодирующих участках генов человека. Некоторые другие типы генетических вариантов могут быть выявлены, но поддаются обнаружению с меньшей вероятностью, чем однонуклеотидные замены: это относится, в частности, к коротким делециям или вставкам (инделам) и изменениям числа коротких тандемных повторов.

Существуют разные типы генетических вариантов. Технология секвенирования нового поколения предназначена, в первую очередь, для поиска однонуклеотидных замен, коротких делеций (потерь участков ДНК) и инсерций (вставок участков ДНК). Однако в определенных участках генома в связи с особенностями метода детекция таких вариантов может быть затруднена или невозможна. Кроме того, вероятность обнаружения других вариантов при секвенировании может быть низкой, в частности затруднена детекция крупных изменений структуры хромосом (инверсии, транслокации, крупные инсерции и делеции), изменений числа хромосом (полиплоидия, анеуплоидия), а также оценка протяженности участков триплетных и других нуклеотидных повторов. Для детекции таких вариантов может быть рекомендовано дообследование с использованием других молекулярно-генетических методов.

В случае когда секвенирование проводится в целях поиска причины, вероятно, наследственного моногенного заболевания, в заключение выносятся патогенные, вероятно патогенные варианты и варианты неопределенной клинической значимости в генах, ассоциированных с заболеваниями, имеющими фенотипическое сходство с описанием клинической картины обследуемого. Варианты в остальных генах в заключение не выносятся (за исключением "вторичных" и "случайных" находок), в связи с чем клиническая информация о состоянии здоровья обследуемого лица является обязательным условием для проведения интерпретации данных секвенирования. Информация о состоянии здоровья обследуемого лица должна быть представлена в максимальном объеме до проведения исследования, в виде результатов исследований (лабораторных и инструментальных), а также заключений врачей и/или выписок из истории болезни. По возможности должны быть предоставлены данные о семейном анамнезе и заболеваниях у других членов семьи.

• Если врач подозревает у пациента наследственную патологию, для диагностики которой не разработано отдельных генетических тестов.
• Если требуется молекулярно-генетическое подтверждение диагноза, а более узкоспециализированные тесты не смогли выявить причину. Такое может быть, если у пациента имеются редкие генетические мутации, не входящие в состав обычных диагностических наборов.
• Если заболевание может быть вызвано мутациями в нескольких генах. В таком случае секвенирование полного экзома будет эффективнее секвенирования всех этих генов классическим методом (по Сэнгеру) по отдельности.

Для интерпретации результатов исследования необходима консультация врача-генетика.

Результатом секвенирования, согласно российским и международным рекомендациям по интерпретации данных секвенирования нового поколения, служит заключение, составленное по определенному образцу (шаблону). Заключение может включать в себя следующие типы клинически значимых вариантов:

"Патогенный вариант" - изменение нуклеотидной последовательности ДНК с достаточной доказательной базой для того, чтобы рассматривать его как вероятную причину наследственного заболевания*.

"Вероятно патогенный вариант" - изменение, приводящее к развитию наследственного заболевания с высокой долей вероятности*.

"Вариант неопределенной клинической значимости" - изменение, относительно которого без дополнительных исследований невозможно сказать, может ли оно вызывать соответствующее заболевание или нет (в случае скрининга на носительство рецессивных вариантов или на носительство вариантов, ассоциированных с риском развития наследственных опухолевых синдромов, у обследуемых без личной истории наследственных заболеваний такой вариант может быть сообщен в исключительных случаях, сообщение не гарантируется).

* Для развития заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования недостаточно наличия у пациента одного гетерозиготного патогенного варианта; такие заболевания развиваются только в случае наличия патогенных вариантов в обеих копиях гена (отцовской и материнской).

• Анализ полного экзома поможет выявить редкие, а также не описанные в научной литературе мутации, но только при наличии клинической картины заболевания у пациента.
• Результативность обследования сильно зависит от наличия информации о варианте во внешних базах данных клинической информации, а также от изученности генетического заболевания пациента. В настоящий момент изучение генетических заболеваний является приоритетным направлением исследований во всем мире и базы данных с клинической информацией постоянно пополняются. В практике клинического секвенирования экзома процент диагностированных случаев растет с каждым годом, поэтому в некоторых случаях переанализ данных секвенирования через некоторое время может привести к установлению диагноза, даже если изначально он не был поставлен.
• Ввиду некоторых технических ограничений секвенирование экзома не может покрыть 100 % целевых участков. Обеспечивается необходимое для достоверного обнаружения гетерозиготных вариантов покрытие: не менее 10х для 90 % целевых участков. Частота ошибочно обнаруженных вариантов при секвенировании экзома в среднем составляет не больше 1 %, но в отдельных участках может достигать 5 %, поэтому релевантные варианты рекомендуется подтверждать независимым секвенированием по Сэнгеру или другими референсными методами, если такая возможность существует.
• Некоторые типы вариантов поддаются выявлению методом экзомного секвенирования плохо, в том числе структурные изменения хромосом (инверсии, транслокации, делеции), полиплоидия, анэуплоидия, протяженные участки триплетных и других повторов, варианты в генах с наличием в геноме близкого по последовательности псевдогена или паралога, варианты в GC-богатых участках, варианты в интронах за пределами стандартных сайтов сплайсинга, а также эпигенетические варианты.
• Метод имеет ограниченную чувствительность в отношении вариантов в состоянии мозаицизма. Чувствительность и специфичность обнаружения вариантов, находящихся в областях сегментарных дупликаций, могут быть низкими. Результаты клинического секвенирования всегда интерпретируются в контексте клинической картины, семейной истории и других лабораторных данных. Изучаются только варианты, которые потенциально могут иметь отношение к заболеванию пациента. Результаты секвенирования экзома могут быть интерпретированы неверно, если предоставленная информация ошибочна или неполна. Некоторые медицинские процедуры, такие как пересадка костного мозга или переливание крови, могут привести к неверным результатам. Редкие безвредные варианты могут быть классифицированы неверно. Выявленные варианты не всегда объясняют все клинические проявления у пациента. Предоставление большего количество клинически значимой информации может помочь более точной оценке значимости выявленных вариантов.
• Секвенирование в целях скрининга на носительство вариантов, в том числе ассоциированных с риском развития наследственных опухолевых синдромов и других заболеваний с поздним началом, не проводится несовершеннолетним обследуемым без соответствующего фенотипа (заболевания).
• В ходе секвенирования выявляется большое количество генетических вариантов (от нескольких десятков тысяч до миллионов в зависимости от объема исследования). Подавляющее большинство этих вариантов представляют собой доброкачественные полиморфизмы и не ассоциированы с развитием наследственных заболеваний. Согласно российским и международным рекомендациям по интерпретации данных секвенирования нового поколения, доброкачественные и вероятно доброкачественные варианты не выносятся в заключение.
• Интерпретация полученных результатов секвенирования может быть осуществлена только врачом-генетиком. Только заключение врача-генетика о клинической значимости выявленных вариантов с учетом клинической картины обследуемого лица может служить основанием для постановки диагноза и принятия клинически значимых решений, в том числе решений по тактике лечения обследуемого лица. Консультация врача-генетика и интерпретация полученных результатов в данное исследование не входят.
• При наличии в анамнезе обследуемого лица переливания крови возможно получение неточного результата секвенирования. Необходимо заранее сообщить лечащему врачу, направляющему на проведение данного исследования, о факте переливания крови для принятия решения о целесообразности проведения исследования.

• Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/.
• Database of Single Nucleotide Polymorphisms (dbSNP). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/.
• Genome Aggregation Database (gnomAD). http://gnomad.broadinstitute.org/.
• ClinVar. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/.
• Clinical Genome Resourse, ClinGene. https://www.clinicalgenome.org/.
• Ensembl. http://www.ensembl.org/index.html.
• Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015.
• Recommendations for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing, 2016 update (ACMG SF v2.0): a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genet Med. 2017.